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如何基于一条老旧的TGF-β信号通路，来发近6分纯生信文呢？

作者：zxn123 | 发布于：2023年03月30日 | 浏览：521 次

撰写：生信小师妹 来源：小张聊科研平台的“ i生信”公众号，微信公众号搜索“ i生信”即可关注/扫描关注见文末

#生信发文# #科研热点# #预后模型# #疾病治疗#

今天小编为大家带来1篇2022年11月发表在Front Pharmacol（IF 5.988）题为“Identification of TGF-β signaling-related molecular patterns, construction of a prognostic model, and prediction of immunotherapy response in gastric cancer”的文章。

原文链接：

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PMID: 36467074

背景

TGF-β信号通路在肿瘤进展和免疫应答中起重要作用。然而，TGF-β信号通路相关基因(TSRGs)与胃癌临床预后、肿瘤微环境(TME)和免疫治疗之间的关系尚不清楚。

TGF-β可由大多数细胞通过自分泌和旁分泌形式产生，如肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。TGF-β信号通路在胚胎发育、肿瘤进展和免疫反应中起着至关重要的作用。在早期肿瘤细胞中，TGF-β信号通路可以抑制增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡，被认为是一种肿瘤抑制因子。然而，在晚期肿瘤细胞中，TGF-β信号通路通过促进血管生成、诱导上皮-间充质转化(EMT)、调节基因组不稳定性和免疫逃逸等机制调节肿瘤复发和转移。此外，TME中成纤维细胞TGF-β信号通路激活诱导的胶原纤维限制T细胞向肿瘤细胞的浸润，从而抑制机体的抗癌免疫反应，被认为是一种免疫抑制细胞因子。目前，大多数研究只关注TGF-β信号通路中的一两个基因，而肿瘤的发生往往是大量基因相互作用的结果。因此，有必要系统分析TGF-β信号通路中多个基因与TME的关系，以发现新的、不同的免疫表型，筛选对免疫治疗敏感的人群，进行更精准的治疗。

展开全文

整体思路

本研究从TCGA和GEO数据库中获得804份胃癌样本，从MSigDB中收集54个TGF-β信号通路相关基因(TSRGs)。作者分析了54种TSRGs在胃癌中的表达水平及基因突变特征，并根据54种TSRGs的表达水平将胃癌患者分为两个不同的TGF-β亚组（TGF-β cluster A 和 TGF-β cluster B）（第一次聚类），并分析了不同分子亚型在预后、临床病理特征和TME方面的差异。

随后，基于两个不同TGF-β亚群之间的差异表达基因（TGF-β clusters-related DEGs），再次聚类得到3个基因簇。

基于TGF-β clusters-related DEGs，使用LASSO回归构建并验证了一个TGF-β相关预后模型。根据中位风险评分将患者分为高危组和低危组。最后，还评估了高危组和低危组患者对免疫检查点抑制剂(ICIs)和抗肿瘤药物的敏感性。

具体成文思路

本研究从TCGA和GEO数据库中获得804份胃癌样本，从MSigDB中收集54个TGF-β信号通路相关基因(TSRGs)。

1、探究TSRGs在胃癌中的差异表达及其遗传变异谱

作者首先对54种TSRGs在胃癌组织和正常胃组织中的差异表达进行了分析，得到43个DEGs (图1A)。

基于String数据库的蛋白-蛋白相互作用网络分析揭示了大多数基因之间的密切联系(图1B)。

接下来，作者探讨了胃癌患者54个TSRGs的体细胞突变水平（图1C）和CNVs改变频率(图1D)及CNV的位置（图1E）。

FIGURE 1 Genetic mutational characteristics of TSRGs in gastric cancer

2、构建TGF-β亚群：A和B，并分析了不同分子亚型在预后、临床病理特征及TSRGs表达方面的差异。

作者根据54种TSRGs的表达水平，将胃癌患者分为两个不同的TGF-β亚组TGF-β cluster A 和 TGF-β cluster B (图2A-C)。

PCA结果进一步证明了良好的分组效果(图2D)。Kaplan-Meier生存分析显示TGF-β cluster B具有更显著的生存优势(p < 0.001，图2E)。此外，作者结合TGF-β亚群和胃癌患者的临床病理特征绘制了54个TSRGs表达热图，发现与TGF-β聚类B相比，TGF-β聚类A中有54个TSRGs表达水平更高(图2F)。

FIGURE 2 Overall survival and clinicopathological characteristics of two different TSRG subgroups.

3、继续，分析TGF-β亚群：A和B的肿瘤免疫微环境（TME）特征及差异

为了探索胃癌中TSRGs和TME之间的相关性，探索角度有：患者基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分较高(图3A-C)；对三个关键免疫检查点基因(PD1、PD-L1和CTLA4)的表达分析 (图3D-F)；使用CIBERSORT算法进一步分析23个免疫细胞的浸润水平（图3G）；GSVA富集分析显示，TGF-β cluster A 和 TGF-β cluster B所富集的信号通路(图3H)。

FIGURE 3 Analysis of the tumor immune microenvironment between two different TGF-β subgroups.

4、基于TGF-β clusters-related DEGs，确定基因簇

基于，TGF-β cluster A 和 TGF-β cluster B分组，作者使用R包limma获得了202个TGF-β clusters-related DEGs，并进行了功能富集分析，GO(图4A)和KEGG分析(图4B)。

然后，对202个TGF-β clusters-related DEGs 进行单因素Cox回归分析，获得了199个与胃癌患者预后（OS）相关的基因。

为了进一步探讨胃癌中与预后相关的DEGs的潜在机制，基于199个预后相关基因的表达水平，采用无监督一致性聚类分析将胃癌患者分为三个不同的基因簇，即gene cluster A, gene cluster B, and gene cluster C。然后进行了3个基因亚群的Kaplan-Meier生存分析 (图4C)，临床病理特征和DEGs表达热图分析（图4D）以及54个TSRGs的表达差异分析(图4E)。

FIGURE 4 Identification of gene subgroups based on DEGs among two TGF-β subgroups.

5、基于TGF-β cluster-related prognostic DEGs，构建和验证预后风险模型

为了量化每个胃癌患者的风险，构建了一个基于TGF-β cluster-related prognostic DEGs的预后风险模型。

首先，使用R包将患者随机分配到训练集和测试集，比例为1:1。

其次，在训练集中，采用LASSO和多元Cox回归分析构建合适的风险模型。LASSO回归分析筛选出12个潜在候选基因(图5A,B)。随后对12个预后相关基因进行多因素Cox回归，得到5个用于构建风险模型的基因，分别为SRPX2、SGCE、DES、MMP7和KRT17。根据公式计算每位患者的风险评分 (图5C)。Sankey图显示了风险评分与TGF-β簇、基因簇、生存状态之间的相关性(图5D)。比较了TGF-β聚类与基因聚类的风险评分的差异(图5E,F)。

FIGURE 5 Construction of the TGF-β cluster-related DEGs prognostic model.

接下来，探究上述预后风险模型的预后价值。

根据中位风险评分将胃癌患者分为高危组和低危组。

首先在Training set中探究：风险评分曲线和生存状态散点图显示，胃癌患者死亡人数随着风险评分的增加而增加(图6A,B)。Kaplan-Meier生存分析显示，高危组患者的OS较低危组患者差(图6C)。风险评分的1、3、5年AUC值分别为0.612、0.668、0.694(图6D)。

同时，分别在两个验证集(the testing set and the entire set)中进行了相同的分析，得到了相似的结果(图6E-L)。进一步在IMvigor210队列中，验证所构建的预后模型的准确性(补充图S2A)。

FIGURE 6 Prognosis value of the TGF-β cluster-related DEGs prognostic model.

6、风险模型的临床相关性分析和分层分析

为了探讨风险评分与现有临床病理特征之间的相关性，我们首先分析了临床亚组的风险评分差异（(图7A-D）。亚组按照age, gender, T stage, and N stage进行分组。

对不同亚组进行Kaplan-Meier生存分析 (图7E-L)。

FIGURE 7 Prognostic model-based clinicopathological characteristics and survival subgroup analysis

7、探讨风险评分是否是胃癌患者的独立预后因素和绘制nomogram

结合临床病理特征，在训练集和两个验证集(the testing set and the entire set)中进行单变量和多变量Cox回归分析 (图8A-F)，证实风险评分是胃癌患者的独立预后因素。(A,B) Univariate and multivariate Cox regression analyses of clinicopathological variables and risk scores with OS in the training set, (C,D) testing set, and (E,F) entire set.

FIGURE 8 The independent prognosis analysis of the risk score and clinicopathological variables in gastric cancer.

鉴于胃癌患者的风险评分与预后密切相关，综合性别、年龄、T分期、N分期和风险评分，绘制nomogram，预测训练集和两个验证集(the testing set and the entire set)的1- 5年、3- 5年生存率(图9A、C、E)。1年、3年和5年的校准曲线比较nomogram预测OS与实际观测OS(图9B、D、F)。

FIGURE 9 Construction and validation of a nomogram for predicting OS in gastric cancer.

8、探讨胃癌患者高危组和低危组肿瘤免疫微环境（TME）的差异

首先进行了ESTIMATE分析。结果显示高危组胃癌患者间质评分、免疫评分、ESTIMATE评分较高(图10A)。

随后，使用7种算法来评估免疫细胞浸润水平与风险评分之间的相关性，如图10B所示。

还将预后模型中的五个基因与免疫细胞之间进行了相关性分析(图10C)。

利用ssGSEA进一步探讨了两个亚组之间16种免疫细胞和13种免疫相关通路的差异 (图10D,E)。

最后，还分析了两个亚组之间免疫检查点相关基因的表达水平，图10F显示。

FIGURE 10 Differential analysis of tumor immune microenvironment between high- and low-risk groups.

9、免疫治疗反应分析

TMB和MSI被认为是肿瘤免疫治疗应答率的生物标志物， TMB和MSI- h高的患者受益于免疫治疗，生存期更长。因此，首先分析了TMB与风险评分之间的相关性 (图11A，B)。根据TMB和风险评分，分为四个亚组，然后进行Kaplan-Meier生存分析 (图11C)。进一步分析了胃癌患者高危组和低危组的体细胞突变 (图11D)。还分析了MSI与风险评分之间的相关性 (图11E)。

IPS和TIDE评分是新的肿瘤免疫治疗应答率生物标志物，可以更好地评估抗PD1和抗CTLA4治疗的疗效。IPS评分高代表免疫原性高，TIDE评分高代表肿瘤免疫逃逸的可能性更大。因此，IPS越高，TIDE评分越低，患者的免疫治疗效果越好。接下来就探究风险评分与IPS和TIDE评分,以及dysfunction, and exclusion score之间的关系（图11F-L）。还基于IMvigor210队列进行免疫治疗应答分析 (补充图S2B)。以上结果提示低危组胃癌患者可能对免疫治疗更敏感。

FIGURE 11 Analysis of immunotherapy response rates between high- and low-risk groups.

10、作者还分析了常见抗肿瘤药物在高危组和低危组间的敏感性差异，为临床抗肿瘤药物联合用药策略提供了新的视角(图12)。

FIGURE 12 Antitumor drug sensitivity analysis of gastric patients in high- and low-risk groups

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